液體活檢（liquid biopsy）是一種通過(guò)采集體液（通常是血液，也可包括尿液、腦脊液、胸腹水等）進(jìn)行分子分析，以評(píng)估疾病狀態(tài)的非侵入性檢測(cè)方法。它為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、療效評(píng)估及耐藥機(jī)制研究提供了重要工具。液體活檢包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs，Circulating Tumor Cells），循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA，Circulating Tumor DNA），腫瘤來(lái)源外泌體（Exosomes），循環(huán)RNA（包括miRNA, lncRNA等）以及血清或血漿蛋白標(biāo)志物（如NSE, LDH等）等。隨著研究的不斷深入，液體活檢在早期診斷、分子分型與靶向治療指導(dǎo)、治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)、耐藥機(jī)制探測(cè)、微小殘留病灶（MRD）監(jiān)測(cè)、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)預(yù)警等方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

     其中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）作為腫瘤來(lái)源的血液中標(biāo)志物，能從基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)和代謝等多個(gè)層面反映腫瘤狀態(tài)。CTCs可單獨(dú)存在，也可與其他腫瘤或非腫瘤細(xì)胞形成聚集體/簇（CTC clusters），后者在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出更強(qiáng)的生存和轉(zhuǎn)移潛能。成人癌癥中已廣泛證實(shí)CTCs在腫瘤殘留、療效監(jiān)測(cè)及復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)中的價(jià)值，但兒童NB的相關(guān)臨床研究仍較少。

     近日，深圳兒童醫(yī)院袁秀麗/文飛球和深圳市瑞格生物科技有限公司劉宗彬等在 BMC Cancer 上發(fā)表了一篇題為“Circulating tumor cells and clusters as liquid biomarkers for the diagnosis and prognosis of neuroblastoma（循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其聚集體作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤診斷與預(yù)后的液體生物標(biāo)志物）”的論文，該研究對(duì)64例新診斷的NB患者（高危40例，中危13例，低危11例）外周血中的CTC 和 CTC 聚集體進(jìn)行了定性定量分析，并與20名無(wú)惡性腫瘤病史的健康兒童相關(guān)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，探討了其對(duì)NB診斷和轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的意義，以及 CTC 和 CTC 聚集體數(shù)量與患者臨床特征之間的相關(guān)性和差異。我們來(lái)了解下。

https://doi.org/10.1186/s12885-025-14448-7

CTC和CTC聚集體檢測(cè)

     該研究通過(guò)微流控CFD-Chip平臺(tái)對(duì)健康兒童和原發(fā)性NB患者外周血樣本中的CTCs和CTC 聚集體進(jìn)行檢測(cè)，研究流程示意圖見(jiàn)圖1A。實(shí)驗(yàn)中，研究人員將NB細(xì)胞系SK-N-SH加入健康血液樣本并注入芯片，CTC平均捕獲效率達(dá)到87.6%（圖1B），顯示該方法具有良好的檢測(cè)靈敏度。

    免疫熒光染色結(jié)果表明，GD2和PHOX2B均為神經(jīng)母細(xì)胞瘤特異性標(biāo)志物，能夠分別標(biāo)記CTCs和CTC 聚集體（圖1C和1D）。CTCs的判定標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)至少一個(gè)NB特異性標(biāo)志物（GD2或PHOX2B）、具有完整核信號(hào)（DAPI+）、且不表達(dá)CD45；而CTC 聚集體則定義為兩個(gè)或以上CTCs的聚集體。

     當(dāng)常規(guī)組織病理活檢因腫瘤急癥（如脊髓壓迫或腹腔高壓綜合征）而無(wú)法開(kāi)展時(shí)，CTC及CTC 聚集體的液體活檢展現(xiàn)出互補(bǔ)的優(yōu)勢(shì)。結(jié)合影像學(xué)檢查，CTC檢測(cè)可輔助快速進(jìn)行NB的初步診斷，從而使患者在病情急進(jìn)階段盡早接受風(fēng)險(xiǎn)分層的化療，減少急診手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥，改善治療反應(yīng)（圖2A–C）。

圖1. 神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）及其聚集體的研究設(shè)計(jì)與免疫熒光鑒定
A，研究設(shè)計(jì)示意圖。記錄NB患者的臨床及病理特征，并采用級(jí)聯(lián)濾網(wǎng)式確定性側(cè)向位移微流控芯片（CFD-Chip）富集外周血中的CTCs和CTC聚集體。
B，CFD-Chip對(duì)PB樣本中SK-N-SH腫瘤細(xì)胞的捕獲效率。
C–D，GD2和PHOX2B被證實(shí)為在CTCs及其聚集體中表達(dá)的NB特異性標(biāo)志物。CTCs的鑒定標(biāo)準(zhǔn)包括表達(dá)至少一種NB特異性標(biāo)志物（GD2或PHOX2B）、具有完整的細(xì)胞核信號(hào)以及不表達(dá)CD45。CTC聚集體定義為兩個(gè)或以上CTCs的聚集結(jié)構(gòu)。比例尺，10微米。

圖2. CTC和CTC聚集體的檢測(cè)使神經(jīng)母細(xì)胞瘤急診患者能夠盡早接受風(fēng)險(xiǎn)分層的化療
A，NB急診治療流程圖示意。影像學(xué)檢查聯(lián)合CTC檢測(cè)等液體活檢手段可輔助快速診斷NB，而組織病理學(xué)診斷耗時(shí)較長(zhǎng)，且在某些情況下難以實(shí)施。
B，代表性后縱隔NB急診的MRI圖像。
（#1）上腔靜脈綜合征：橫斷面脂肪抑制增強(qiáng)T1加權(quán)成像顯示左側(cè)后縱隔存在一大片不均勻強(qiáng)化腫塊，病灶侵犯椎管，包繞并推動(dòng)相應(yīng)脊髓，跨越中線(xiàn)生長(zhǎng)，累及鄰近氣管、食管、上腔靜脈及主動(dòng)脈弓。
（#2）脊髓壓迫：橫斷面T2加權(quán)成像顯示右側(cè)后縱隔有一大片輪廓清晰的腫塊影，病灶占位效應(yīng)明顯，鄰近縱隔向左側(cè)移位，局部病灶長(zhǎng)入相鄰椎管，壓迫并移位相應(yīng)脊髓。
C，通過(guò)蘇木精-伊紅（H&E）染色及免疫組織化學(xué)方法對(duì)NB患者進(jìn)行組織病理學(xué)診斷。
（1）小圓形腫瘤細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，圍繞神經(jīng)原纖維呈Homer-Wright玫瑰花結(jié)樣排列；
（2）骨髓活檢組織中可見(jiàn)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞；
（3）免疫組化顯示腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)TH（酪氨酸羥化酶）染色陽(yáng)性；
（4）免疫組化顯示腫瘤細(xì)胞胞核PHOX2B染色陽(yáng)性。比例尺，50微米。

CTC和CTS聚集體用于NB早期篩查和診斷

      在健康兒童中未檢測(cè)到CTCs或CTC聚集體，而原發(fā)NB患者的CTCs和CTC聚集體檢出率和數(shù)量均顯著升高（p < 0.001）。ROC曲線(xiàn)分析進(jìn)一步驗(yàn)證了CTCs和CTC 聚集體在區(qū)分健康兒童與初診NB患者中的潛在診斷價(jià)值。

CTC和CTS聚集體計(jì)數(shù)與NB腫瘤部位和分期相關(guān)

     研究還發(fā)現(xiàn)CTC和CTC 聚集體數(shù)量與患者的性別、年齡以及MYCN基因擴(kuò)增狀態(tài)無(wú)顯著相關(guān)性（p > 0.05），提示CTCs可能作為一種獨(dú)立于MYCN擴(kuò)增狀態(tài)的預(yù)后生物標(biāo)志物。

     然而，不同的原發(fā)腫瘤部位、風(fēng)險(xiǎn)分層、病理類(lèi)型以及分期之間的CTC和CTC 聚集體數(shù)量存在顯著差異。

• 原發(fā)于腹膜后區(qū)的NB患者，其CTC和CTC 聚集體數(shù)量顯著高于縱隔或其他部位的NB（p = 0.0018 和 p = 0.0171），這可能部分解釋了腹膜后NB預(yù)后較差的原因。

• 高危組的CTC和CTC 聚集體數(shù)量顯著增加（p = 0.0038 和 p = 0.0013），表明這兩項(xiàng)指標(biāo)與高危特征密切相關(guān)。

• 神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的CTC和CTC 聚集體數(shù)量均高于間變型神經(jīng)節(jié)母細(xì)胞瘤（GNBi）、神經(jīng)節(jié)瘤（GN）和節(jié)結(jié)性NB（GNBn）（p = 0.0003 和 p = 0.0157），反映其與腫瘤惡性程度相關(guān)。

• 4期患者的CTC和CTC 聚集體陽(yáng)性率和數(shù)量顯著高于1、2、3期（p = 0.0088 和 p = 0.0001）。

• 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M期）患者的CTC和CTC 聚集體數(shù)量也顯著高于局限性L1、L2和Ms期患者（p = 0.0008 和 p < 0.0001）。

CTCs和CTC聚集體可預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移，CTC聚集體可提示骨髓轉(zhuǎn)移

       研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移以及任何類(lèi)型遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NB患者，其CTC和CTC 聚集體數(shù)量顯著高于未轉(zhuǎn)移患者（p < 0.001）。研究者利用ROC曲線(xiàn)評(píng)估了CTC和CTC 聚集體在預(yù)測(cè)骨髓轉(zhuǎn)移中的診斷效能，發(fā)現(xiàn)其在初診患者中具備較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)能力，尤其在無(wú)創(chuàng)識(shí)別骨髓轉(zhuǎn)移方面展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。

CTCs和CTC聚集體聯(lián)合NSE與LDH在神經(jīng)母細(xì)胞瘤診斷中的應(yīng)用

       NSE和LDH雖然是NB中常用的腫瘤標(biāo)志物，但其特異性較低，且會(huì)受到治療引起的細(xì)胞死亡影響。研究發(fā)現(xiàn)，在新診斷的NB患者中，CTCs和CTC聚集體的數(shù)量與NSE、LDH以及骨髓最小殘留病灶（BM MRD）水平呈顯著相關(guān)，特別是CTC聚集體與BM MRD的相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.8089（p < 0.0001）。有趣的是，CTCs和CTC聚集體的數(shù)量與腫瘤體積無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，支持腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移是相對(duì)獨(dú)立的過(guò)程。

OS預(yù)測(cè)

      研究隨訪(fǎng)截止至2024年6月30日，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為1131天（范圍6至1900天）。64名患者中有6例死亡。死亡患者的CTC和CTC 聚集體數(shù)量顯著高于存活患者（p=0.0266和p=0.0043）（圖8A、C）。通過(guò)Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析，采用5.5個(gè)CTCs/2 mL作為分界值，將患者分為CTC高組和低組，高組的死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，風(fēng)險(xiǎn)比（HR）為9.503（95% CI：1.892–47.74，p=0.0063）（圖8B）。同樣，依據(jù)2.5個(gè)CTC 聚集體/2 mL的閾值分組，CTC 聚集體高組患者的HR為7.776（95% CI：1.457–41.51，p=0.0164）（圖8D），均表明CTCs及CTC 聚集體含量較低者預(yù)后較好。

      此外，對(duì)40例高危NB患者的亞組分析顯示，死亡組與存活組CTC數(shù)量差異不顯著，但死亡組CTC 聚集體顯著更多（圖8E）。死亡高?；颊?/span>CTC 聚集體數(shù)量的最低值為75個(gè)/2 mL，CTC 聚集體數(shù)高于該閾值的高?；颊呦噍^于低于閾值者，死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，HR達(dá)19.09（95% CI：2.976–122.4，p=0.0019）（圖8F）。

圖8. CTC和CTC聚集體數(shù)量與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者初診時(shí)的OS相關(guān)

A，死亡患者的CTC數(shù)量顯著高于存活患者。（Mann-Whitney檢驗(yàn)，p = 0.0266）

B，CTC高組患者相比CTC低組的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）為9.503（95% 置信區(qū)間：1.892–47.74，p = 0.0063，Log-rank檢驗(yàn)）。

C，死亡患者的CTC聚集體數(shù)量顯著高于存活患者。（Mann-Whitney檢驗(yàn)，p = 0.0043）

D，CTC聚集體高組患者相比低組的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）為7.776（95% 置信區(qū)間：1.457–41.51，p = 0.0164，Log-rank檢驗(yàn)）。

E，對(duì)于高危NB患者，死亡組（5例）與存活組（35例）之間CTC數(shù)量無(wú)顯著差異，但CTC聚集體數(shù)量顯著較高。（Mann-Whitney檢驗(yàn)）

F，高危患者中，2 mL外周血中CTC聚集體數(shù)量≥75的患者，相較于低于該閾值者，風(fēng)險(xiǎn)比（HR）為19.09（95% 置信區(qū)間：2.976–122.4，p = 0.0019，Log-rank檢驗(yàn)）。

目前正在進(jìn)行更長(zhǎng)期的隨訪(fǎng)，以進(jìn)一步觀察患者病情發(fā)展趨勢(shì)。

討論與結(jié)論

     首先，研究基于高效捕獲的CFD微流控芯片技術(shù)，從新診斷NB患者外周血中分離鑒定CTCs和CTC 聚集體，未在健康兒童中檢測(cè)到，顯示出良好的特異性。與成人實(shí)體瘤中常用的CK和EpCAM標(biāo)志物不同，NB中這些標(biāo)志物表達(dá)較低，過(guò)去關(guān)于NB CTCs的研究尚處于初步階段，且大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)匱乏。本研究是迄今為止規(guī)模最大的NB CTC及CTC聚集體檢測(cè)報(bào)告，首次系統(tǒng)揭示了CTC聚集體在NB診斷和預(yù)后中的臨床價(jià)值。

     其次，研究顯示CTCs和CTC聚集體在NB診斷中具備較高的靈敏度和特異性，尤其對(duì)于難以活檢的原發(fā)腫瘤部位尤為重要。CTC及其聚集體數(shù)量在不同原發(fā)部位及風(fēng)險(xiǎn)分層中存在顯著差異，且與骨髓轉(zhuǎn)移和整體轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，特別是腹膜后NB表現(xiàn)出更高的CTC及CTC聚集體數(shù)量，解釋了其較差預(yù)后。

     此外，CTC聚集體的存在與骨髓轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，對(duì)于難以進(jìn)行侵入性骨髓穿刺的急診患者，液體活檢提供了無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)的疾病狀態(tài)評(píng)估手段。CTC檢測(cè)還可用于最小殘留病灶和早期復(fù)發(fā)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并有望作為GD2陽(yáng)性患者分層和靶向治療的標(biāo)志物，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

    值得注意的是，CTCs及CTC聚集體數(shù)量與腫瘤體積無(wú)顯著相關(guān)，支持轉(zhuǎn)移與腫瘤生長(zhǎng)為相對(duì)獨(dú)立過(guò)程的觀點(diǎn)，提示靶向轉(zhuǎn)移機(jī)制的新思路。

    最后，CTCs及CTC聚集體與傳統(tǒng)血清標(biāo)志物NSE、LDH及骨髓MRD呈顯著相關(guān)，聯(lián)合應(yīng)用顯著提升骨髓及全身轉(zhuǎn)移的診斷準(zhǔn)確性。同時(shí)，CTCs≥5.5/2 mL或CTC聚集體≥2.5/2 mL與較差的總體生存顯著相關(guān)，高危患者CTC聚集體≥75/2 mL更需嚴(yán)密監(jiān)控。

    結(jié)論：CTCs和CTC聚集體作為NB的重要無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物，不僅反映腫瘤的臨床和病理特征，還為早期診斷、風(fēng)險(xiǎn)分層、轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)及治療監(jiān)測(cè)提供了有力工具，未來(lái)有望促進(jìn)NB精準(zhǔn)診療和新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。